تست PCR : اصول، مراحل ، کاربرد ، مزیت ها، محدودیت ها و انواع  آن

تست PCR یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی و تحقیقاتی است و کاربردهای نامحدودی در عرصه های مختلف زیست مولکولی دارد. از این تکنیک به‌عنوان روشی سریع ، دقیق  و حساس برای تشخیص بیماری‌های عفونی، نمونه سلول غیر طبیعی یا تشخیص تغییرات ژنتیکی که می‌توانند باعث بیماری شوند و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی استفاده می کنند.

در این مقاله و در مقالات بعدی مروری بر موضوعات زیر خواهیم داشت و تکنیک PCR را با جزئیات بیشتری بررسی می‌کنیم:

• PCR  چیست؟
• اساس واکنش PCR چیست ؟
• مراحل PCR
• PCR چگونه انجام می شود؟
•  کاربردهای PCR
• معایب و مزایای روش PCR
• انواع تکنیک ها و روش های PCR
• انواع مواد و اجزا مورد نیاز (Master Mix)در PCR
• تفاوت مستر میکس one-step و two-step
• قسمت های مختلف دستگاه PCR و انواع تجهیزات مورد نیاز
• آشنایی با پارامتر های موجود در PCR
• عوامل تاثیر گذار در تست PCR
• تفسیر نتایج در PCR
• اهمیت طراحی پرایمر و  انتخابtarget gene در غربالگری و  تشخیص عوامل عفونی و بیماری ها
•  جایگاه  PCR در تشخیص آزمایشگاهی
• معرفی کیت های موجود در بازار
• معرفی انواع دستگاه ها موجود در بازار

PCR چیست؟

PCR مخفف  Polymerase Chain Reaction  ( واکنش زنجیره ای پلیمراز ) است . امروزهPCR  یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخییص پزشکی و تحقیقاتی است  که کاربردهای زیادی دارد. از این تکنیک به‌عنوان روشی سریع ، دقیق  و حساس برای تشخیص بیماری‌های عفونی، نمونه سلول غیر طبیعی یا تشخیص تغییرات ژنتیکی که می‌توانند باعث بیماری شوند و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی استفاده می کنند.

PCR تکنیکی است که در آزمایشگاه برای ساخت میلیون‌ها نسخه از یک بخش خاص از DNA استفاده می‌شود. در سال ۱۹۷۱، Khorana و همکارانش روشی را برای همانند سازی یک ناحیه از DNA دو رشته ای با استفاده از دو پرایمر گزارش کردند که در آن انتهاهای ‘۳ به سمت یکدیگر طراحی شده بود. هرچند استفاده از این روش به صورت چرخه های تکراری در یک واکنش تکثیری، در ابتدا در سال ۱۹۸۳ توسط Kary Mullis در شرکت Cetus توسعه یافت ، او در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را برای اختراع خود دریافت کرد.

اساس واکنش PCR چیست ؟

برای استفاده و تشخیص در  آزمایش‌های مولکولی و ژنتیکی معمولاً مقادیر زیادی DNA لازم است،با استفاده از این تکنیک می توان در یک سیستم بافری ساده یک قطعه خاصی ازDNA الگو (تارگت) را با استفاده از پرایمر و آنزیم DNA پلیمراز در لوله آزمایش به میزان زیادی تکثیر و جدا کرد.به این جهت، پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی اختصاصی طراحی می شوند که بر اساس قوانین کلی  جفت شدن بازها، به DNA الگو متصل می شوند و موجب تکثیر آن قطعه خاص می شوند.

با استفاده از PCR می توان هزاران تا میلیون ها نسخه از یک بخش خاص از ژنوم (تارگت) را از مقدار بسیار کمی DNA تولید کرد. هیچ محدودیتی در انتخاب قطعه مورد نظر وجود ندارد و ممکن است حاوی تمام یا بخشی از ژن‌های رمزکننده یک پروتئین‌، RNA یا بخشی از یک  بیومارکر یا حتی بخش کوچکی از یک پلازمید باشد.

 مراحل PCR

سه مرحله اساسی وجود دارد که در تمام انواع PCR مشترک است ، در این فرآیند ابتدا رشته های DNA الگو با استفاده از حرارت عمدتاً با دمای حدود ۹۶-۹۲ درجه سانتیگراد به مدت ۲ دقیقه از هم جدا می شوند، حرارت باعث می شود که پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازهای رشته های DNA شکسته شوند (Denaturation)،  سپس  در دمای پایین تر حدود  ۵۵-۴۵ درجه سانتیگراد پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی توالی های مکمل خود را بر روی DNA الگو پیدا و به آن وصل می شوند (Annealing)، در نهایتDNA  پلیمراز مقاوم به حرارت با اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتیدها در انتهای OH-‘3 پرایمرها  در دمای بهینه که معمولا حدود ۷۲ درجه سانتیگراد  است ، باعث ایجاد مولکول های جدید از روی هر دو رشته میشود(Extension). با توجه به اینکه  مراحل در یک ترمو سایکلر خودکار که دما را تغییر می دهد  به دفعات زیاد در حدود ۳۰-۲۰ بار در مدت زمان کوتاهی تکرار می شود، تعداد نسخه های توالی DNA هدف به صورت تصاعدی طبق فرمول ⁿ۲ (تعداد سیکل n=)افزایش می یابد.محصول تکثیر شده  بر اساس روش مورد استفاده با متد های خاص مورد ارزیابی قرار میگیرد.

کاربردهای PCR

PCR معمولاً به یک آزمایش تشخیصی سریع و دقیق برای علائم اولیه یک بیماری عفونی یا ژنتیکی اشاره دارد ،جهت تشخیص عفونت های میکروبی، تکنیک های معمول در آزمایشگاه ها شامل کشت و شناسایی ارگانیسم و بررسی های سرولوژیکی نظیر حضور آنتی بادی اختصاصی ضد باکتری در بیماران می باشد. تست های شناسایی معمولاَ وقت گیر بوده و بررسی های ایمنولوژیکی نیز گاهی حساسیت لازم را ندارند و یا در مراحل اولیه بیماری قابل اندازه گیری نمی باشند.

امروزهPCR   یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی و تحقیقاتی است و کاربردهای نامحدودی در عرصه های مختلف زیست مولکولی دارد. علت اصلی آن است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف مورد استفاده قرار داد. بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود:

۱- تهیه نسخه های متعدد از یک ژن

برای تکثیر یک قطعه از DNA نوترکیب و یا تهیه نسخه های زیاد از یک ژن خاص جهت تعیین توالی آن  می توان از PCR استفاده کرد.

۲- بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در DNA

 بدون شک، کاربرد دوم PCR مهمترین کاربرد آن و علت اصلی گسترش روز افزون آن در کلیه شاخه های علوم زیستی می باشد. کاربردهای مختلف و وسیع PCR در این زمینه شامل مراحل اولیه پردازش DNA برای تعیین توالی، برای تشخیص وجود یا عدم وجود یک ژن برای کمک به تعیین کمی و کیفی و تعیین ژنوتایپ عوامل عفونی ، هنگام تولید پروفایل های DNA در پزشکی قانونی از نمونه های کوچک DNA، به عنوان یک روش تشخیص سریع  و زودهنگام   برای تشخیص نقص ژنتیکی ، تعیین جنسیت جنین، تشخیص جهش ها و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی یا سلول غیر طبیعی ، تشخیص ویروس ایدز در سلول های انسانی، کاربردهای جرم شناس و تحقیقات ژنتیکی و غیره را متحول کرده است…

معایب و مزایای روش PCR

استفاده از PCR برای نشان دادن حضور ژن های ویرولانس در باکتری ها بسیار معمول است و هرچند در جهت تشخیص سریع بکار می رود ولی موجب ریشه کنی روش های فنوتیپی و مرسوم در آزمایشگاه ها نمی شود. تنها حضور ژن در میکروارگانیسم نشان دهنده بیان آن نیست بلکه میزان بیان ژن، فنوتیپ را مشخص می سازد که آن نیز تحت کنترل شرایط کمپلکس محیطی و سایر ژن های باکتری است .

از PCR برای تشخیص سریع میکروارگانیسم های بیماریزای خطرناک، ارگانیسم هایی که به سختی در محیط های مصنوعی رشد می کنند و یا آنهایی که اصلاً قابل کشت نمی باشند نیز استفاده می شود. مثلاَ Mycobacterium tuberculosis (عامل بیماری سل)که یک باکتری بسیار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمایشگاه حدود ۲۰ روز طول می کشد. در این مورد برای تشخیص، نمونه های خلط بیماران باید هضم و علاوه بر کشت، بررسی میکروسکوپی شوند که برای متصدیان آزمایشگاه نیز خطرناک  می باشد…..